想說的話

自2010版藥典開始，每五年一次的藥典升級(jí)都對(duì)微生物檢驗(yàn)的要求上一個(gè)臺(tái)階，留在記憶里的2015版藥典升級(jí)前的那些日子仍舊歷歷在目，讓我們?cè)?020版藥典升級(jí)前回顧一下2015版升級(jí)前的那些點(diǎn)滴，以準(zhǔn)備迎接即將到來的2020版。

【備注】

以下文章為2015年編寫，僅為了拋磚引玉。

1、自查2015版是否做到位做扎實(shí)；

2、其中有些應(yīng)對(duì)方法（該方法指的是管理和應(yīng)對(duì)策略）可對(duì)2020版的升級(jí)準(zhǔn)備有所啟發(fā)和借鑒。

ROUND 4

2015版中國(guó)藥典微生物項(xiàng)變化的應(yīng)對(duì)策略：

菌種

上一篇使用大篇幅說了培養(yǎng)基，也是真正揭開這次連載的一些實(shí)施細(xì)節(jié)，其實(shí)寫這個(gè)連載的目的是希望大家不要對(duì)藥典微生物項(xiàng)升級(jí)那么多內(nèi)容抓狂，而是真正靜下心來想想其背后的意義和對(duì)于我們今后的工作會(huì)帶來什么。原本是想將培養(yǎng)基和菌種一起寫的，寫到后來發(fā)現(xiàn)如果寫在一篇，確實(shí)有些內(nèi)容會(huì)講的不夠細(xì)，所以將培養(yǎng)基和菌種拆開了，這次我們就來談?wù)勎覀冾B皮的菌種君吧！

1、 檢驗(yàn)用菌種的選擇

在藥典第三次征訂意見稿《9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》的“菌種”項(xiàng)下有這么一句話“藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株”。這句話寫明了中國(guó)藥典對(duì)檢驗(yàn)用菌種的挑選原則，感覺上可以使用CMCC（中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心）、ATCC（美國(guó)典型菌種保藏中心）、NCTC（英國(guó)典型菌種保藏中心）等等，近還有供應(yīng)商給我推薦CICC（中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心）的菌種。但是我們作為遵循中國(guó)藥典的企業(yè)來說，中國(guó)藥典微生物限度及無菌檢查項(xiàng)下的菌種是明確寫明僅可使用CMCC的菌種，所以大家沒有必要去挑戰(zhàn)，如果你使用ATCC的菌種，檢查官到時(shí)候問你ATCC和CMCC的區(qū)別，我相信我們這種等級(jí)的肯定是說不清的，這個(gè)項(xiàng)目是中檢所在做的研究，所以我們不去做這樣的挑戰(zhàn)，乖乖的選擇符合我國(guó)國(guó)情的CMCC菌種即可，免去一系列無意義的解釋。

當(dāng)然有些企業(yè)的產(chǎn)品需要出口，要符合出口國(guó)的藥典標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)外相對(duì)來說就放寬很多，但是也有一部分國(guó)家不太承認(rèn)我們的CMCC菌種。在我的工作經(jīng)歷中，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)的審計(jì)官員對(duì)微生物方面了解的甚少，但是有次我們企業(yè)請(qǐng)了一名國(guó)外資深專家來我們公司全面審計(jì)的時(shí)候，他一看我們檢出的環(huán)境菌種就娓娓道來，讓我很吃驚，我不知道是不是國(guó)外對(duì)于微生物這塊的重視程度和我國(guó)還有一定差距還是什么，他們的藥典中對(duì)于檢驗(yàn)菌種的挑選也不止一種，認(rèn)可范圍更加寬泛。現(xiàn)在迎審過程中，我們微生物實(shí)驗(yàn)室更多的是解釋而非探討，我們也希望國(guó)內(nèi)的檢查團(tuán)隊(duì)中能多一些對(duì)微生物了解的老師來給我們幫助和指導(dǎo)。

2、 檢驗(yàn)用菌種的管理

我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)于菌種的管理也歷經(jīng)了不少波折，現(xiàn)在的管理模式和使用下來的效果還是比較令人滿意的，菌種其實(shí)怕就是其活力消退或變異。有些外企的管理模式真的非常方便，使用定量菌株直接實(shí)驗(yàn)，可能現(xiàn)在還不太適用于我們大部分國(guó)內(nèi)企業(yè)，因?yàn)樗麄兪褂玫亩烤晔茿TCC等授權(quán)的國(guó)外企業(yè)制造并供貨的，特別是M家的產(chǎn)品，我就不多說了以免有廣告嫌疑，國(guó)內(nèi)應(yīng)運(yùn)而生的定量菌株我個(gè)人還是保留意見。出去培訓(xùn)時(shí)還是會(huì)發(fā)現(xiàn)有很多國(guó)內(nèi)企業(yè)對(duì)于菌種的管理方式特別是保藏方法存在一定問題，菌種死亡變異的事件還是時(shí)有發(fā)生。以下我就介紹下我們企業(yè)的菌種管理模式，并介紹2種比較方便的菌種保藏方法。

藥典的標(biāo)準(zhǔn)菌株大部分企業(yè)都會(huì)有以下七種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，這些菌種我們是依據(jù)保藏的效期，在每年的年末購(gòu)買一次，購(gòu)買的是次年要過保藏效期的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。這里大家可能就會(huì)有疑問了，為什么我們只有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株，那是因?yàn)槲覀冎毁?gòu)買CMCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，即0代菌株，僅保藏使用0代復(fù)蘇出來的1代標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株，使用的即是1代標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株復(fù)蘇的2代菌株，這樣避免活力及變異事件的發(fā)生，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室日常也沒有精力去處理這些事情，所以在10版藥典的時(shí)候，我們就把管理模式重新調(diào)整了一下，整個(gè)流程為菌株申購(gòu)→菌株驗(yàn)收→菌株確認(rèn)→菌株保藏→菌株領(lǐng)用→菌株使用→菌株銷毀。

1） 菌株申購(gòu)

購(gòu)買檢驗(yàn)用菌株，必須由檢驗(yàn)用菌株的管理人員提出申請(qǐng)、陽(yáng)性室負(fù)責(zé)人審核、部門經(jīng)理批準(zhǔn)后方可進(jìn)行購(gòu)買，公司的采購(gòu)人員必須憑著被簽批的單子才能夠進(jìn)行菌種的購(gòu)買，因?yàn)檫@畢竟關(guān)系到生物安全問題，所以申購(gòu)必須慎重。

2） 菌株驗(yàn)收

每支過來的0代安瓿必須經(jīng)過確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室至少要進(jìn)行菌落形態(tài)和革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)，有條件的話通過生化或其他方法確認(rèn)到屬種。該實(shí)驗(yàn)是確認(rèn)菌株的純度、活力和特性，我們是確認(rèn)復(fù)蘇后的1代標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株，即我們保藏的菌株，保證保藏的菌株的質(zhì)量。

3） 菌株保藏

其實(shí)在確認(rèn)同時(shí)我們即進(jìn)行了保藏，若確認(rèn)不合格，則銷毀該批次保藏批的菌株，我們實(shí)驗(yàn)室的保藏方法很簡(jiǎn)單，也是借鑒08-09年我的領(lǐng)導(dǎo)去中檢所培訓(xùn)帶回來的保藏方法，即使用液體培養(yǎng)基復(fù)蘇菌液，然后加入等量的20%甘油，制成含10%甘油的菌懸液，然后分裝至1ml/支，可以保存2年，但是黑曲霉我們是保藏孢子懸液，貯存于-15℃以下，有效期是1年。

現(xiàn)在也有很多實(shí)驗(yàn)室使用磁珠法保藏也是覺得效果不錯(cuò)，其保藏后貯存在2-8℃，效期1年。

兩個(gè)方法各有利弊，甘油冷凍法每次實(shí)驗(yàn)使用一支，不會(huì)重復(fù)使用，避免重復(fù)凍融對(duì)菌株的挑戰(zhàn)以及重復(fù)開管引入的污染；但是磁珠法因?yàn)槭呛脦最w磁珠放在一管保存液里，每次使用會(huì)從該管里夾取一粒復(fù)蘇，可能重復(fù)操作引入污染，但是其優(yōu)勢(shì)在于對(duì)冰箱溫度要求不高，一般實(shí)驗(yàn)室都有滿足2-8℃的冰箱，而甘油冷凍管需要冷凍室進(jìn)行保存，所以對(duì)沒有—15℃以下溫度保證的實(shí)驗(yàn)室來說，還需購(gòu)買相應(yīng)設(shè)備，這個(gè)就是各自實(shí)驗(yàn)室去評(píng)估選擇了。

這里我還是不太建議使用斜面，一兩個(gè)月就要轉(zhuǎn)一次，日常事情較多且對(duì)于菌株的確認(rèn)其實(shí)在傳代過程中也需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，這樣又帶來附加實(shí)驗(yàn)，一支買來的商業(yè)派生菌株（一般在省所買來的少也是2代了，基本都會(huì)是3代這種）管不了太久又需要買了，本來很多微生物實(shí)驗(yàn)室人手就不夠，轉(zhuǎn)種的多還要多配培養(yǎng)基，沒必要把精力放在這些事情上，如果實(shí)驗(yàn)室沒有冷凍冰箱，那可以考慮磁珠法，有的話可以考慮甘油冷凍法，這樣可以把工作菌株的使用有效期延長(zhǎng)到1-2年。

還有要提一下保藏培養(yǎng)基的問題，之前金葡、大腸、枯草、銅綠都是使用營(yíng)養(yǎng)肉湯，生孢使用硫乙醇，白念使用馬丁，黑曲霉使用TSA進(jìn)行復(fù)蘇，15版使用TSB、SDB、SDA了，我暫時(shí)不考慮更換細(xì)菌培養(yǎng)基，因?yàn)楫吘故褂媚敲炊嗄瓯２匦Ч容^理想，而且TSB有糖的問題，不過我還是覺得營(yíng)養(yǎng)肉湯早晚會(huì)退出歷史舞臺(tái)，與其等到那時(shí)候束手無策，畢竟菌株保藏都是以年來計(jì)算的，到時(shí)候沒得賣就完蛋了，還不如把事情做在前面，在保證菌株儲(chǔ)備齊全的情況下，同步要挑戰(zhàn)使用TSB保藏金葡、大腸、枯草、銅綠的實(shí)驗(yàn)（至少1年），生孢依舊硫乙醇，白念使用SDB，黑曲霉使用SDA。還有使用新的培養(yǎng)基復(fù)蘇的菌濃問題，基本都比老的長(zhǎng)的好，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以先行試一下。

4） 菌株領(lǐng)用

我們保藏菌株的冰箱是雙人雙鎖，2 把鎖分別在陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)人員及陽(yáng)性室負(fù)責(zé)人手上，日常取用菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)必須2人到場(chǎng)開冰箱取菌株，并在菌株領(lǐng)用臺(tái)賬上說明領(lǐng)用日期、原因、領(lǐng)用人等信息，保證菌株的流通可控。

5） 菌株使用

說到菌株使用我覺得我還是有些實(shí)驗(yàn)潔癖的，很多實(shí)驗(yàn)室是在生物安全柜內(nèi)幾個(gè)菌一起做，比如今天有3個(gè)菌的實(shí)驗(yàn)，都會(huì)安排在一起做。但是在我們實(shí)驗(yàn)室，我是嚴(yán)格要求在A菌和B菌之間必須清場(chǎng)，A菌實(shí)驗(yàn)使用的稀釋液、槍頭盒等必須撤離現(xiàn)場(chǎng)，消毒安全柜后開紫外燈30min以上，才可進(jìn)行B菌株實(shí)驗(yàn)，并且B菌實(shí)驗(yàn)使用的肯定不能是A菌實(shí)驗(yàn)使用余下的那些稀釋液和槍頭。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生的氣溶膠是我們?nèi)庋劭床灰姷模m然在混勻菌液時(shí)候我們是蓋緊試管蓋的，但是在打開蓋時(shí)我無法判斷是否有帶菌氣溶膠跑到空氣中沾到哪里，我承認(rèn)只要是無菌操作過關(guān)是不會(huì)交叉污染的，但是我不敢冒這個(gè)險(xiǎn)，還是老老實(shí)實(shí)遵循著避免交叉污染的宗旨，就和生產(chǎn)清場(chǎng)的概念一樣。

還要提一下黑曲霉，其實(shí)國(guó)內(nèi)有很多廠家還沒有購(gòu)買黑曲霉，當(dāng)時(shí)他們問我的時(shí)候，我真的很奇怪他們?cè)趺赐ㄟ^新版GMP審核的，這個(gè)暫且不論，反正我們實(shí)驗(yàn)對(duì)黑曲霉的處理倒是挺順利的，當(dāng)時(shí)10版藥典和中檢所SOP上都寫著用棉花放在管口防止孢子飛出什么的，我嫌麻煩，于是想了個(gè)法子，我們的試管是用膠質(zhì)的試管塞的，斜面上黑曲霉長(zhǎng)好后，用一次性注射器吸取稀釋液從試管塞與試管的縫隙中插進(jìn)去，因?yàn)樵嚬苋怯袕椥缘模敲醇?xì)的針頭是肯定能從其邊緣插進(jìn)去的，記得塞子始終保持緊閉，然后將液體打入管內(nèi)直至覆蓋所有黑曲霉生長(zhǎng)的范圍，然后微微震蕩將孢子洗脫出來，洗脫后，將塞子打開（因?yàn)樗芯w均以被液體覆蓋故孢子飛散可能性降低很多）使用槍頭或移液管吸取孢子懸液進(jìn)行稀釋即可，當(dāng)然取原液時(shí)候的動(dòng)作應(yīng)快速，減少其氣溶膠與空氣的接觸時(shí)間，至少我們實(shí)驗(yàn)室沒有發(fā)生過一次污染，而且黑曲霉的實(shí)驗(yàn)接入量控制的也很穩(wěn)定。

對(duì)于菌株梯度稀釋定量的問題，這里我就不多說了，這個(gè)只有多加練習(xí)了，而且每個(gè)人的梯度確實(shí)會(huì)有偏差，我們實(shí)驗(yàn)室是定好復(fù)蘇后的培養(yǎng)時(shí)間，比如金葡培養(yǎng)24h，那以后每次都是這個(gè)時(shí)間，這樣的菌濃一般都差不多，比較好控制，這個(gè)就是勤練！當(dāng)然你的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基必須質(zhì)量穩(wěn)定，否則到時(shí)候因?yàn)橛?jì)數(shù)培養(yǎng)基的質(zhì)量問題而導(dǎo)致你一直認(rèn)為自己稀釋的功夫不到家就沒話說了。我們實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)都是當(dāng)天直接稀釋并接種的，菌量的成功率還是很高的，當(dāng)然實(shí)驗(yàn)人員都是下了一定功夫的，特別是那個(gè)比較無語(yǔ)的50-100cfu。

黑曲霉的孢子懸液、枯草的芽孢懸液和生孢的芽孢懸液都是可以經(jīng)過驗(yàn)證增加貯存時(shí)間的，具體的方法可以去網(wǎng)上查文獻(xiàn)，我覺得這個(gè)還是很有用的，使用起來很方便，關(guān)鍵減少工作量啊！！加個(gè)方法驗(yàn)證即可，惡心小段時(shí)間，舒服大段時(shí)間！

6） 菌株銷毀

這里的菌株除了保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株外，還有使用該菌株復(fù)蘇出的菌液、梯度稀釋的菌懸液以及菌株計(jì)數(shù)平皿，這些銷毀都是要記錄在案的，這個(gè)就是整個(gè)的流通過程，菌株的銷毀也是要經(jīng)過陽(yáng)性室負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)后執(zhí)行，并且銷毀后還需要陽(yáng)性室負(fù)責(zé)人復(fù)核確認(rèn)。

3、 菌種實(shí)驗(yàn)室（生物安全實(shí)驗(yàn)室）的認(rèn)證及安全管理

在新版GMP中對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照室有明確的規(guī)定，必須符合P2生物實(shí)驗(yàn)室級(jí)別，現(xiàn)在還是有很多藥企的微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)P2這個(gè)概念有點(diǎn)模糊，這里解釋一下，P2實(shí)驗(yàn)室即二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，相當(dāng)于BSL-2級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室，該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室主要用于初級(jí)衛(wèi)生服務(wù)、診斷和研究，其實(shí)驗(yàn)對(duì)象的危害等級(jí)為Ⅱ級(jí)（中等個(gè)體危害，有限群體危害），具體定義為“能引起人類或動(dòng)物發(fā)病，但一般情況下對(duì)健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病源體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和 預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限”。這類的實(shí)驗(yàn)室就是P2級(jí)的實(shí)驗(yàn)室。其實(shí)大家日常并不陌生，只是看到了沒注意而已，在各大醫(yī)院都是有生物安全實(shí)驗(yàn)室的，只要是黃色醒目的標(biāo)牌上面有生物安全標(biāo)示（生化危機(jī)里的那個(gè)），上面寫著無關(guān)人員不得入內(nèi)等，那就是生物安全實(shí)驗(yàn)室了。

剛剛提到了P2實(shí)驗(yàn)室相當(dāng)于就是BSL-2級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室，那我們的陽(yáng)性室基本上應(yīng)該都是要符合BSL-2級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室的，BSL-2級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室是可以在各省市或區(qū)縣的進(jìn)行認(rèn)證備案的，那也就是說如果檢查官問你，請(qǐng)問你們實(shí)驗(yàn)室是否符合P2實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求，那你不用多做解釋，只需將BSL-2級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室的備案證書給他就可以了，在前面列舉的那些如銅綠假單胞菌、白色念珠菌均屬于BSL-2級(jí)病原微生物，這個(gè)備案也需要一定過程，的老師會(huì)根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)室布局提出自己的意見，我們實(shí)驗(yàn)室是經(jīng)過設(shè)施改造后終達(dá)標(biāo)的，每年均會(huì)進(jìn)行一次突擊的飛行檢查（不會(huì)提前一天，比如9點(diǎn)打電話10點(diǎn)就到現(xiàn)場(chǎng)了），我個(gè)人覺得管理力度還是非常夠的，能很好的督促我們嚴(yán)格的管理我們的生物安全實(shí)驗(yàn)室。

那對(duì)于使用菌株的生物安全實(shí)驗(yàn)室，安全問題非常非常的重要，菌株的無故外泄、人員實(shí)驗(yàn)室的溢撒事件等等都是一系列需要關(guān)注的問題。我們?cè)陉?yáng)性室設(shè)置門禁，避免無關(guān)人員進(jìn)入；在設(shè)備方面我們盡量做到陽(yáng)性室，如菌株保藏冰箱、菌株培養(yǎng)箱、菌株滅菌器，這些全部設(shè)置在生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部；對(duì)于生物安全的管理設(shè)有專門的生物安全委員會(huì)，有處理各種生物安全事件的應(yīng)急預(yù)案，每年都會(huì)進(jìn)行應(yīng)急演練并拍照和錄像，每年會(huì)對(duì)整個(gè)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行整體評(píng)估出具評(píng)估報(bào)告，并且每年對(duì)生物安全實(shí)驗(yàn)室的人員進(jìn)行生物安全培訓(xùn)，讓每一位參與菌株實(shí)驗(yàn)的人員都明白其中的重要性。

菌株的事情可大可小，我們?cè)谡J(rèn)識(shí)這種活體小東西的同時(shí)必須盡可能的了解它們的特性，讓它們?yōu)槲覀兯茫⒈M量避免安全事故的發(fā)生（SARS就是從實(shí)驗(yàn)室出去的。。。），所以我們必須特別小心謹(jǐn)慎的操作它們，重要的還是這點(diǎn)——保護(hù)好自己！

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